膜蛋白鉴定
膜蛋白(如受体)和离子通道是细胞功能的关键的调节因子。目前已知三分之二的靶向药物与膜蛋白有关,因此膜蛋白在靶向药物研发领域及其重要。G蛋白耦合受体(GPCRs)是最多的、最通用的膜蛋白受体,50%以上的人类药物靶点与其相关。在癌症、心血管疾病、代谢、中枢神经系统和炎症疾病都与G蛋白耦合受体有关。目前G蛋白耦合受体占工业药物靶向受体的50%,相关研发药物在全球的销售额高达200亿美元,但依然有相当大的潜力,因为在人体内全部的G蛋白耦合受体中目前只有5%~10%用于药物靶向。
离子通道是另一类重要的膜蛋白药物靶点,占目前市场上药物的10%。尽管膜受体很重要,但众所周知,要制备出纯的、正确折叠的、足够数量的膜受体用于药物发现是非常有挑战性的。
膜蛋白服务主要包括:
1. G蛋白偶联受体(GPCRs)是1号膜上最大、用途最多的一组。从细胞质、细胞周质或细胞培养上清中纯化。根据所使用的表达宿主或表达载体,蛋白需要从细胞质、(细菌)周质或细胞培养上清中纯化,我们已经建立了针对这些应用的优化方案。
2. 用于增溶和纯化的缓冲液和洗涤剂的筛选。
对于可溶性蛋白和膜蛋白,使用差示扫描荧光法(DSF)确定了最佳的稳定缓冲条件。如果适用,可以进行已建立的活性测定来关联稳定性和活性状态。对于膜或附膜蛋白质,需要用洗涤剂从细菌或真核生物的膜中提取蛋白质。在提取和纯化过程中,洗涤剂优化了蛋白质的稳定性。如果蛋白质表现为包涵体,则进行再分解和重折叠,包括筛选最佳的洗涤和缓冲条件。
3.应用His、Rho1D4、GST或strep标记的亲和纯化。
His、GST或Strep标记的蛋白的纯化可使用HIT高质量的亲和纯化基质进行。针对目标膜蛋白纯化条件在小范围内得到优化,升级可达到mg量。如有必要,缓冲液和清洁剂进行条件优化,以提供最佳的稳定性和活性的蛋白质。
4.进一步纯化步骤,以得到结晶准备的均质蛋白质馏分。
为了获得高纯度、均匀的适合于蛋白质结晶实验或功能结合测定的蛋白质组分,可以使用阴离子或阳离子交换色谱或凝胶过滤进行第二或第三个纯化步骤。
HIT可提供以下膜蛋白鉴定的生物信息学服务:
1.功能注释和富集分析 2. 聚类分析 3.网络分析 4.统计分析