蛋白质印记法&电子转移分析
蛋白质印迹法（Western blot）
Western Blot是一种广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等分子生物学领域的分析方法，用于检测组织匀浆或提取物样本中的特定蛋白。印迹指的是将大分子转移到固定化膜上进行特异性、灵敏的检测。
在Western Blot分析中，样品中的蛋白质首先在凝胶电泳中通过等电点(pI)、分子量、电荷或这些因素的组合，使用SDS-PAGE和IEF等多种方法进行分离。通常选择使用SDS- page进行分离，因为所有的蛋白溶解并向同一方向迁移，并且由于SDS的变性作用，表位更容易获得。凝胶电泳分析后，将蛋白质从凝胶内移到由硝化纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的膜上，使其可用于抗体检测。PVDF膜对蛋白质的结合能力高于硝基纤维素，但硝基纤维素对小分子蛋白质的结合能力较好。
电子转移分析
转移蛋白质的主要方法称为电印迹法，即用电流将蛋白质从凝胶中拉到PVDF或硝化纤维膜中。电泳转移有几种方法:罐吸、半干吸和半湿吸。这三种方法的共同之处在于，凝胶和膜形成了一个两面都有一叠滤纸的夹层。如果采用等电聚焦分离蛋白，通过压力吸附扩散转移蛋白的效率更高。在电印迹过程中，蛋白质从凝胶内部移动到膜上，同时保持它们在凝胶内的组织。印迹过程大约需要1小时(半干印迹)到过夜(池印迹)，然后将蛋白暴露在较薄的表面层上进行抗体检测。此外，膜的自由结合位点被蛋白质混合物阻断，这不会干扰随后的抗体探测。蛋白质首先被一抗检测，然后被二抗检测，二抗识别这个特殊的一抗。二抗与一组特异性分子结合，可通过后续高灵敏度的显影程序轻松检测。
最敏感的检测方法是使用增强化学发光(ECL):抗体-辣根结合物识别一抗;底物反应与能在一定时间内产生化学发光发光的二次反应相耦合。这种光信号是通过将薄膜暴露在x射线胶片上而积累起来的，或者将其放入一个绝对黑暗的柜中，用灵敏的CCD相机记录下信号。通过一种特殊的ECL变体，可以检测到1 pg的蛋白条带。
除上述应用，Western Blotting还可用于跟踪蛋白磷酸化。与多磷酸化蛋白的所有异构体结合的抗体在2D凝胶上显示出与“串珠”类似的形式。Western Blotting对鉴定免疫共沉淀降低的复合物中的已知和未知蛋白也很有用。一旦感兴趣的蛋白被定位到Western blot上，相应的斑点就可以从重复的考马西蓝染凝胶上切下来，并用MS进行鉴定。
